细胞复苏的步骤
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f细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。一、细胞冷冻保存1、材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSOSigmaD2650、无菌塑料冷冻保存管Nalge
e50000020、wvtrypa
blueGibcoBRL15250061、血球计数盘与盖玻片、等速降温机KRYO10SeriesII2、冷冻保存方法：1传统方法冷存管置于4℃10分钟20℃30分钟80℃16～18小时或隔夜液氮槽vaporphase长期储存。20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。2程序降温：利用已设定程序的等速降温机以1～3℃分钟之速度由室温降至80℃以下120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：1冷冻前2448小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。2配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜DMSO至20浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。3离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液约计数细胞浓度及冻前存活率。4取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液DMSO最后浓度为5～10，使细胞浓度为1～5×106cellsml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2mlvial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：1欲冷冻保存之细胞应在生长良好logphase且存活率高之状态，约为80～90致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。2细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力在70度可保存数月。3注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色以FGLPTelflo
过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD2650，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10甘油冻存。4冷冻保存之细胞浓度r